ANTICORPS MONOCLONAUX

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Les anticorps monoclonaux et prot ines defusion th rapeutiquesPr Renato MONTEIROService d ImmunologieH pital Bichat.
G K hler 1946 1995 et C Milstein 1927 2002 Travaux sur les my lomes Prot ine de Bence Jones Publication en 1975 Les hybridomes.
Prix Nobel de m decine en 1984 avec N K Jernes for theories concerning the specificity in development and controlof the immune system and the discovery of the principle forproduction of monoclonal antibodies D finition.
Anticorps monoclonal Population homog ned anticorps issus d un seul et unique clone de cellules B.
Avantage Sp cificit Affinit Production massive et Diff rence entre s rum polyclonal et anticorps monoclonal.
Voie de synth se des bases puriques et pyrimidiquesAminopt rineHypoxanthine Orotic acidGuanine Orotidine MPInosine 5 P.
HGPRT Uridine MPGuanosine MP Ad nosine MP Cytidine MP UPDGDP ADP Cytidine DPGTP dGTP ATP dATP CTP dCTP UTP dUMPAminopt rine.
RNA DNA dTTP dTDP TK Les hybridomesPrimo immunisation2 semaines1 3 mois.
Saign e TestsD velopper et testerla m thode de cribblage La productionDernier rappel.
Expandre et congelerClonage en cellule uniqueCribblage et expansiondes clones positifs Production des anticorps monoclonaux.
L immunisation Les sources d antig nes degr depuret limination descontaminants.
hapt nes prot ines L immunisation de l animal dose et forme del antig ne adjuvants.
voie et nombre d injection Dose antig neAntigen Quantity of immunogen per injection per mouseProtein lyophilized protein 2 50 gin solution 2 50 g.
included in polyacrylamide gel slices 1 10 gHapten Peptide 1 10 gNucleotideCarbohydrate and related compoundsChemicals natural and synthetic compounds .
Adjuvants Augmentation de l intensit de la r ponseimmunitaire Accroissement de l effet m moire Stimulants non sp cifiques de la r ponse.
immunitaire 3 composantes principales huile min rale eau protection de l antig ne transport del antig ne particules agr gation de l antig ne d p t antig nique.
parois de bact ries r action inflammatoire Les animaux Nombre d injectionsExemple Immunisation d une souris pour la fusion des lymphocytes des ganglionsday 0 7 15 21 28 35 Fusion.
injection 1st 2nd 3rd 4th 5th 6thsera pre immuneLapin 120 200 gPoulet 40 80 gSouris 8 200 g.
Exemple de calendrier de productionGeneral ProcedureStep Time month 1 2 3 4 5 6Develop and test screening method.
ImmunisationFusion selection and screeningCloning and isotypingDelivery of clones Technique d hybridation cellulaire ou hybridome.
Les partenaires de fusion cellules B extraites d organes lympho des secondaires rate ganglions cellules my lomateuses cellules MOPC de souris Balb c M thode de fusion.
Chimique Physique S lection clonage Expansion Lign es cellulaires my lomes .
Technique d hybridation cellulaire ou hybridome 2 Fusion chimique Poly Ethyl ne Glycol PEG fusion des membranes cytoplasmiques rendement de fusion de l ordre du 1 10 5 cellules DMSO renforce la viabilit cellulaire.
utilisation de facteurs de rencontre Fusion physique Electrofusion Ouverture de pores dans la cellule par des pulses lectriques technique on reuse.
moins destructrice Technique d hybridation cellulaire ou hybridome 3 S lection sur milieu s lectif HAT Hypoxanthine Aminopterine Thymidine facteurs de croissance IL6 mercaptoethanol.
s rum de veau f tal fibroblastes sous atmosph re CO2 seuls les hybridomes se d veloppent 1 x 105 cellules ml.
M thodes de criblage ou screening Reproductible Fiable Rapide Bon march .
Automatisable Versatile M thodes de criblage ou screening Immuno pr cipitation Ouchterlony Mancini.
R actions d agglutination H maties Particules de latex Radio immunologie RIA radio isotope.
Immuno enzymologie EIA enzyme ELISA Compteur de cellules Cell sorter Western Blot Immuno Analyse Enzymatique.
2 techniques Comp tition Sandwich la plus utilis e pour ce propos l antig ne est pris en sandwich entre deuxanticorps .
l anticorps de capture immobilis en exc s sur la plaque le conjugu enzymatique Utilis pour le dosage d antig nes multivalents Poids mol culaire lev de l antig ne tapes de s parations n cessaires.
ELISA sandwichElimination desAnticorps de captureantig nes non retenusimmobilis s.
Antig nes doser1 re tape d incubation immunologique ELISA sandwichConjugu immuno enzymatique2 me tape d incubation immunologique.
ELISA sandwichS Produit color Enzymes et substratsP nitroph nyl Phosphate ELISA5 bromo 4 chloro 3 indolyl Blotting.
Phosphatase alcaline phosphate Histologienitro blue tetrazoliumNaphtol AS TR phosphate BlottingFast red RC Histologie 2 2 azino bis 3 ethylbenz ELISA.
thiazoline 6 sulfonic acid O phenylenediamine ELISA3 3 5 5 teramethylbenzidine baseor dihydrochloride TMB Peroxidase.
3 3 diaminobenzidine Histologie3 amino 9 ethylcarbazole AEC Histologie4 chloro 1 naphtol 4ClN Histologie S lection du clone producteur.
S lection d une seule cellules et mise en culture Clonage dans l Agar dans l Agarose Clonage sur m thyle cellulose par dilution limite par micromanipulation.
par trieur de cellules Technique d hybridation cellulaire ou hybridome Clonage dans l Agar dans l Agarose on visualise directement les colonies cellulaires dansl agar que l on remet en culture apr s dilution .
Clonage par dilution limite la plus utilis e dans les laboratoires R alis e directement dans une plaque de microtitration peu on reuse longue fastidieuse laborieuse .
Production des anticorps monoclonaux en grande Production en en batch flacons ou plaques de cultures cellulaires 40 100ml rendement de de l ordre du g ml.
production relativement pure contaminant par les substituts de s rum Techniques de microencapsulation flacons rendement de de l ordre de 0 1g ml.
exemple du proc d de la soci t DAMON corporation Production en micro particules Capture des hydridomesdans des billesd alginate.
pas de contamination purification simplifi e Production en micro particules 2 100 mg Production.
industrielle Production en ascites Injection des hybridomes dans le p ritoine de souris D veloppement d une tumeur ascite Pr l vement des anticorps par ponction de liquide.
d ascite Purification du liquide d ascite n cessaire Rendement lev 20 g l C est la souris qui r gule les conditions de culture Production par les bio r acteurs.
Bas sur la technologie des fibres creuses Diminution des co ts du temps Augmentation de la production 3 5 g l de la puret thiquement acceptable Pas ou peu de contaminant 6 x moins .
R acteur fibres creuses principe Capillaire qui formedes fibres avec unseuil de dialyse bien Circulation du milieu.
les cellules sed veloppent dans lemilieu extra capillaire Seuls les nutrimentspeuvent passer d un.
milieu l autre R acteur fibres creusesNutrimentsM tabolitesOxyg ne Anticorps.
Tec No Mouse200 mg qq g moishttp www integra biosciences c... Production de petitequantit d anticorps.
De 60 200 g moishttp www biovest com Cellex BiosciencesMaximizer production de l ordre de 5 g mois Production in vitro.
Avantages Inconv nients Tous les hybridomes ne Pas d utilisation d animal prolif rent pas en r acteur Production de grandes N cessite l utilisation de s rumquantit d anticorps de veau f tal.
Pas de contraintes l gales Probl mes lorsque lesglycosylations sont l utilisation d animaux n cessaires Pas de personnel Productions moinsd animalerie concentr es .
Pas de contaminant Contamination par leshybridomes morts Mab de plus faible affinit Plus ch re pour de petites.
production Production in vivo Avantages Inconv nients Concentration lev e en Utilisation de l animalMab Pr sence de prot ines.
Pas d interm diaire murinesindustriels Contaminants Stress de la souris Purification des liquides contenant les anticorps Pr paration de l chantillon.
Purification principale Chromatographie d affinit Affinit immunologiques sp cifique du Fc sp cifique de l antig ne .
Chromatographie changeuses d ions Chromatographie changeuse d anion L change de cation.
HydroxylapatiteImpuret s Chromatographie d affinit Chromatographie d affinit Elution par d placement Elution par d placement.
avec l antig ne libre avec un analogue Crit res de qualit Sp cificit Reconnaissance d un seul motif pitopique R actions crois es non sp cifiques .
Maintient de l activit apr s modification chimique L affinit lev e Constante et contr l e Avantages de ce type de production.
Constante reproductible Utilisation de la souris Limites de ce type de production La souris ne reconna t pas tous les motifs antig niques.
R pertoire immunologique limit Manifestations secondaires Inflammation N crose tissulaire Difficult pour obtenir des anticorps monoclonaux humains.
Immortalisation des cellules B humaines tr s difficile Volet thique de la manipulation de cellules humaines Qualit des plasmocytes humains tr s variable 109 cellules B par immunisation Les anticorps recombinants.
Anticorps coliclonaux Les moyens actuels Immunologie fondamentale Connaissance du g nome des immunoglobulines G nie g n tique clonage syst mes d expression.
E coli s cr tion p riplasmique Levure Pichia pastoris Cellules d insectes Cr ation de banques de donn es de g nesd immunoglobulines.
Phage display Library D veloppement de techniques d indentification performantes Industries pharmaceutiques et soci t s biotechnologies Sanofi Aventis Genovac FDA AFFSAPS.
Production des anticorps monoclonaux Nouvelles technologies dans la productiond anticorps monoclonaux Syst me d anticorps partir de phage recombinant exemple du kit Pharmacia.
Voir cours sur les anticorps recombinants Principe d obtention d une Phage Display Library Extraction de l ARNm d un plasmocyte ou d une cellule B matrice Hybridomes pour des anticorps murins Cellules de la rate chez des souris immunis es.
Cellules du sang Tissus lympho des humains Obtention du cDNA par action de la transcriptase reverse Amplification du cDNA par Polymerase Chain Reaction PCR S lection des g nes codant pour les chaines lourdes et l g res Construction d un plasmide avec les deux g nes.
Int gration dans un phage pour expression S lection du bact riophage pour introduction dans le syst med expression Mise en culture Extraction des anticorps s cr t s.
Obtention par lectroporation G nes des immunoglobulines Avantages Fragment de liaison minimal taille variable et adaptable minimise la clearance.
Facilite la p n tration dans les cellules tumorales Taux de diss mination plus rapide Augmentation de la valence valence sup rieure 2 Liaison deux antig ne diff rents.
Augmentation de l avidit vitesse de r action augment e Flexibilit augment e facilitation de la liaison avec l antig ne Nouvelles mol cules.
Monovalents Fragments Fv 30 kDa Multivalents Multisp cifiques ScFv 60 kDa .
diabodies 60 kDa triabodies 90 kDa t trabodies SynopsisExtraction Transcriptase reverse PCR.
Cellule B LS lectionExpressionBact riophageS cr tion.
Les anticorps monoclonaux et protéines de fusion thérapeutiques Pr Renato MONTEIRO Service d’Immunologie Hôpital Bichat En dehors du risque infectieux (3-4 % d’infections sévères) et du risque de tuberculose qui est à présent bien « maîtrisé », le risque de lymphomes doit faire l’objet d’une attention particulière: Rapport bénéfices/risques des anti-TNF dans les MICI ...

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